Tipi di microscopi a fluorescenza

Epifluorescenza

Configurazione più comune. Una sorgente (lampada al mercurio/xeno) illumina attraverso un filtro che seleziona una stretta banda di lunghezze d'onda. La luce filtrata raggiunge il campione tramite l'obiettivo. I fluorofori (etichette molecolari) assorbono luce a lunghezza d'onda corta ed emettono a lunghezza d'onda lunga. Un secondo filtro blocca la luce d'eccitazione, lasciando solo la fluorescenza del campione.

Confocale

L'epifluorescenza raccoglie luce da tutto il campo visivo, incluso fuorifuoco. Il microscopio confocale usa un laser focalizzato sul piano di messa a fuoco e un foro stenopeico davanti al rivelatore che blocca la luce non proveniente dal piano focale. Scansionando il campione, si ottiene un'immagine tridimensionale pulita.

Multifotone

Risolve i problemi di allineamento del confocale. Usa un laser a metà energia necessaria per eccitare i fluorofori: l'eccitazione avviene solo dove due fotoni colpiscono simultaneamente il fluoroforo (foco strettissimo). Nessuna luce di fondo, nessun foro stenopeico da allineare.

Riflessione totale interna (TIRF)

La luce d'eccitazione viene diretta lateralmente nel vetrino, penetrando solo in uno strato sottilissimo a contatto col vetro. Solo i fluorofori vicinissimi alla superficie emettono luce. Ideale per studiare processi di membrana (es. neuroni).

Super-risoluzione

Tecniche per superare il limite di diffrazione (~200 nm). SIM (illuminazione strutturata) e STED (depletion da emissione stimolata) riducono la dimensione del punto di eccitazione, permettendo di risolvere singole molecole (pochi nm).